核心内容摘要
单元测试在C++项目中的实践
作者Evil Genius老家躺平中。
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昨晚没通宵今天要回村里了在同学这儿玩了好几天了。
服务器操作、linux、R、python的基础大家过关了么老东家诺禾、兰卫都在招聘生信人员还有华大等好单位也在招聘技术、产品人员如果大家硕士马上毕业想进企业的话现在我觉得是好时候当然了今时不同往日了18年我参加工作的时候几乎是小白从头培养现在不行了要求大家必须有相关背景语言基础是必须要过关的公司的分析服务全部都是建立在服务器上的所有的分析都是封装传参的所以linux、R、python的基础是必须要过关的入职之后一周就会考试考大家linux、R、python语言基础我那时候五道题第一题最简单一般就是用代码得到一段DNA序列的反向互补序列还有差异分析、绘图等最后一题是最难的基本就是大家的工作组学方向比如单细胞就是要求封装基础分析的全代码要求以传参的方式运行大家都可以用80分过关一天内交卷如果不过关还有第二次机会就是第二周如果还不行转岗或者离开我那时候都是自己的领导看的一般都放水了很少有不过的但是随着越来越卷考核成了交叉考核越来越难了现在更是要求入职之前必须有生信背景了反正大家如果想进企业的话 基础一定要做好针对生信方向的语言培训2025番外--linux、R、python培训自己要多看看。
今天我们分享文献结果
大规模结直肠癌单细胞图谱构建现在发个单细胞文章都是大数据量著称样本特征患者构成包括487例CRC患者中位年龄58岁、99例息肉患者中位60岁及64例对照个体中位57岁。
亚型与分期CRC患者中包括254例结肠癌、63例直肠癌89例为MSI-H型268例为MSS型TNM分期涵盖I–IV期I期41例II期121例III期171例IV期110例。
样本类型涵盖原发肿瘤组织674例、肝转移灶175例、非恶性远端组织284例、血液样本103例及淋巴结样本42例。
10X BD为了捕获中性粒细胞。
marker我们搜集一下细胞类型标记基因上皮细胞/癌细胞亚群Colonocyte-likeFABP1, CEACAM7, ANPEP, SIBEST4BEST4, OTOP2, SPIBGoblet-likeMUC2, FCGBP, ZG16, ATOH1Crypt-likeLGR5, SMOC2Transit-amplifying-likeTOP2A, UBE2C, PCLAF, HELLS, TK1高增殖性癌细胞LGR5, TOP2A, MKI67循环癌细胞EPCAM免疫细胞亚群CD4 T细胞CD4CD8 T细胞CD8A调节性T细胞FOXP3NK细胞NKG7, TYROBPγδ T细胞TRDV1, TRGC1初始B细胞IGHD, TCL1A记忆B细胞CD27, CD44活化B细胞CD69, CD83浆细胞JCHAIN, IGHA1, IGHG1, IGHM单核细胞VCAN, CD14巨噬细胞C1QA, C1QB肥大细胞TPSB2, CPA3树突状细胞cDC1CLEC9A, XCR1树突状细胞cDC2CD1C, CLEC10A浆细胞样树突状细胞IL3RA, GZMB嗜酸性粒细胞CLC, CCR3中性粒细胞CXCR2, FCGR3B固有淋巴样细胞IL4I1, KIT祖细胞CD24, AXL干细胞样细胞LEF1周期相关细胞MKI67, CDK1结果
单细胞层面肿瘤微环境表征实现肿瘤免疫表型分层基于bulk转录组数据的共识分子分型CMS
及TME分型利用构建的单细胞图谱提供了TME细胞组成的高分辨率解析。
肿瘤免疫表型分层通过Leiden聚类分析研究揭示了四种明确的免疫表型cluster免疫荒漠型无显著免疫细胞浸润T细胞主导型以CD8⁺、CD4⁺及调节性T细胞为主B细胞主导型以B细胞、IgA/IgG浆细胞为主髓系细胞主导型以巨噬细胞/单核细胞为主值得注意的是T细胞主导型患者具有显著更高的MSI发生几率。
髓系细胞共识基因表达程序鉴定鉴于髓系细胞在塑造免疫抑制性TME中的关键作用研究采用非负矩阵分解技术识别出两类核心表达程序细胞活性程序基础功能细胞周期、上皮细胞互作、代谢环境响应热休克/未折叠蛋白反应、干扰素反应、缺氧反应免疫调节程序免疫抑制反应、炎症反应、B细胞/浆细胞互作程序、T细胞互作程序细胞身份程序包括树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞及中性粒细胞等谱系特征中性粒细胞程序特征中性粒细胞共识程序以炎症基因IL1A、IL1B及肿瘤相关中性粒细胞标志物OLR
VEGFA、PLAU为特征提示其功能多样性。
尤为重要的是分析发现中性粒细胞同样表达T细胞互作程序进一步支持中性粒细胞在肿瘤促进与抑制中的双重作用。
结果
整合bulk RNA-seq数据揭示基因型-免疫表型关联大多数单细胞测序研究缺乏全面的癌症基因型信息与生存数据。
针对bulk的基因组、转录组数据进行详细分析。
生存关联有利预后因素B细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞以及CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、γδ T细胞等适应性免疫细胞浸润与患者生存改善显著相关。
不良预后因素内皮细胞、基质细胞及中性粒细胞富集与较差的生存结局相关。
微卫星状态差异MSI型肿瘤相较于MSS型肿瘤呈现出更丰富的先天性与适应性免疫细胞浸润包括T细胞与中性粒细胞。
驱动基因突变影响KRAS突变肿瘤显著富集中性粒细胞浸润。
BRAF突变肿瘤呈现中性粒细胞等免疫细胞的缺失模式。
通过健康供体来源的原代中性粒细胞与患者来源的结直肠癌类器官条件培养基进行功能共培养实验KRAS突变驱动中性粒细胞向促肿瘤表型极化表型转变KRAS突变类器官培养基能显著上调LOX-1OLR1编码并降低CD181表达这两种均为肿瘤相关中性粒细胞的标志物。
同时维持成熟中性粒细胞标志CD16⁺的比例并显著延长中性粒细胞存活时间。
转录组特征中性粒细胞暴露于KRAS突变条件后其肿瘤相关基因如OLR
IL1A表达上调证实发生了功能性重编程。
基因型特异性BRAF突变类器官培养基对TAN表型诱导作用微弱而野生型培养基影响最弱凸显KRAS突变的特异性驱动作用。
功能验证使用KRAS突变细胞系LoVo、HCT116重复实验结果一致。
经KRAS突变条件重编程的中性粒细胞可抑制CD8⁺ T细胞活化CD69表达下调但不影响CD4⁺ T细胞。
综上所述这些结果证实了KRAS依赖的机制能够促进中性粒细胞的存活及其向肿瘤相关中性粒细胞TAN样表型的极化从而为KRAS突变型结直肠癌中中性粒细胞富集的肿瘤微环境特征提供了功能性关联依据。
结果
循环及肿瘤相关中性粒细胞具有多样且可塑的表型BD单细胞数据多重免疫荧光染色证实LOX-1⁺中性粒细胞cluster仅存在于肿瘤组织中提示LOX-1可能是一种跨癌种的TAN标志物。
中性粒细胞亚群与功能分化中性粒细胞可分为3个血液亚群BN1-BN3和4个TAN亚群TAN1-TAN4。
轨迹分析显示中性粒细胞从血液迁移至组织后发生转录组重塑并分化为两个主要方向促肿瘤表型TAN4高表达IL1A/IL1B驱动髓系异常增生产生炎症与免疫抑制微环境。
抗原呈递表型TAN2/TAN3高表达HLA-DRA等抗原呈递相关基因形成具有抗肿瘤潜能的“杂交中性粒细胞”。
流式细胞术证实TAN的HLA-DR蛋白表达显著高于血液及癌旁组织中性粒细胞。
临床预后意义在独立队列n210中肿瘤核心区高密度的HLA-DRA⁺中性粒细胞与患者较好预后相关且该效应在早期肿瘤中更为显著。
相反肿瘤边缘区的HLA-DRA⁺中性粒细胞则与不良预后相关提示细胞空间定位对肿瘤进展调控具有关键作用。
结果
空间单细胞多模态分析揭示功能性中性粒细胞生态位多重免疫荧光染色观察发现中性粒细胞在肿瘤微环境中占据空间上独特的聚集区域空间结构特征肿瘤核心区与侵袭边缘呈现明显的空间结构异质性与免疫浸润模式差异。
中性粒细胞在肿瘤核心和侵袭边缘均以聚集簇的形式空间定位经HE染色与免疫组化验证。
功能性生态位解析通过图深度学习模型Niche Compass基于已知的细胞互作通路定量识别功能性细胞生态位生态位分类肿瘤与间质区域可明显区分。
进一步识别出富含髓系细胞的生态位与中性粒细胞生态位。
中性粒细胞生态位特征中性粒细胞高表达IL1B。
该生态位中的成纤维细胞部分癌细胞上调趋化因子CXCL
CXCL
CXCL1的表达。
IL1B受体IL1R1特异性表达于成纤维细胞提示中性粒细胞通过IL-1信号激活癌症相关成纤维细胞。
细胞互作网络成纤维细胞通过CXCL5/3/1–CXCR1/2轴募集中性粒细胞形成正反馈环路。
蛋白层面验证利用成像质谱流式技术对29例III期结肠癌样本进行空间蛋白组分析蛋白层面再现了单细胞转录组识别的TME细胞组成。
确认肿瘤核心与侵袭边缘均存在中性粒细胞富集的空间邻域进一步验证了中性粒细胞的空间组织结构。
机制与临床意义研究发现中性粒细胞而非癌细胞是IL1B的主要来源可通过IL-1信号极化癌症相关成纤维细胞塑造免疫抑制微环境并可能介导治疗抵抗。
这一机制为针对IL-1通路如阿那白滞素的联合治疗策略提供了理论依据。
综上空间多模态分析揭示了中性粒细胞通过特定生态位与成纤维细胞形成功能互作单元共同驱动TME重塑并影响治疗反应。
结果
小鼠模型再现人类中性粒细胞在多组织区室中的表型特征探究中性粒细胞沿“骨髓-血液-肿瘤”轴的表型变化基于肿瘤类器官移植的原位小鼠模型将携带四种常见CRC驱动突变Apc/p53/Smad4功能丧失、Kras功能获得的AKPS类器官移植至小鼠结肠黏膜成功模拟晚期人类CRC的浸润特性中性粒细胞表型动态变化沿“血液→肿瘤”路径中性粒细胞呈现渐进性激活激活标志物上调SiglecF、CD11b、CD
PD-L1表达逐步升高。
抗原呈递能力增强肿瘤与结肠组织中性粒细胞的MHC-II蛋白表达高于血液中性粒细胞。
骨髓表型稳定骨髓中性粒细胞表型变化轻微。
关键发现Siglec-F⁺中性粒细胞的定位与意义Siglec-F⁺中性粒细胞主要定位于结肠与肿瘤部位在循环与骨髓中极少见。
该亚群属于成熟、长寿命的促肿瘤细胞其选择性清除可能为靶向髓系细胞的免疫治疗提供新方向。
结果
骨髓-肿瘤轴分析揭示结直肠癌中肿瘤诱导的粒细胞生成中性粒细胞的谱系演变与转录重编程聚类特征鉴定出11个成熟与2个未成熟中性粒细胞簇其转录模式与人类数据集中的血液中性粒细胞及TAN标志基因高度一致。
促炎基因表达结肠与肿瘤中性粒细胞高表达Il1a/Il1b且骨髓中性粒细胞也表达Il1b提示肿瘤信号可远程诱导中性粒细胞前体的免疫抑制性编程。
骨髓中的早期改变健康小鼠骨髓中富集的第10簇细胞处于G2/M期表明无肿瘤信号时增殖性中性粒细胞在骨髓中停留更久。
肿瘤小鼠的髓系前体GMP与中性粒细胞前体已呈现成熟化趋势GMP高表达成熟标志S100a8/a9。
前体细胞下调Elane、Prtn3等祖细胞特异性基因。
迁移轨迹与表型提前改变拟时序分析显示中性粒细胞沿“骨髓→血液→结肠/肿瘤”的渐进式迁移路径。
差异基因分析证实中性粒细胞在进入肿瘤组织前骨髓与血液阶段已发生转录表型改变表明肿瘤系统性影响中性粒细胞的早期分化。
功能干预实验靶向中性粒细胞的治疗潜力使用抗Ly6G抗体特异性清除中性粒细胞选择性清除Siglec-F⁺促肿瘤中性粒细胞但总中性粒细胞数不变提示骨髓持续补充新细胞。
改善TME免疫状态治疗后肿瘤中耗竭性CD4⁺PD-1⁺ T细胞减少提示清除促肿瘤中性粒细胞可缓解T细胞耗竭。
结论与展望研究在单细胞层面描绘了CRC小鼠模型中中性粒细胞沿骨髓-肿瘤轴的动态表型演变证实肿瘤可系统性改变髓系生成诱导中性粒细胞前体提前成熟并具免疫抑制特性。
靶向中性粒细胞如清除Siglec-F⁺亚群能够重塑TME缓解T细胞耗竭。
未来需进一步探索靶向IL-1信号通路以逆转肿瘤诱导的粒细胞异常生成或选择性清除Siglec-F⁺中性粒细胞是否可作为潜在治疗策略。
最后来看看方法生活很好有你更好