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基础性质多肽名称Tumor Necrosis Factor α (46-

(human)人源肿瘤坏死因子 α(46-

多肽序列Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-OH单字母序列NQLVVPSEGLYLIYSQVLFK-OH等电点pI理论值

8~

3酸性氨基酸负电荷略占优势弱酸性特征使其在生理 pH

0-

4环境中带少量负电荷可与 TNFR 胞外域的碱性氨基酸残基形成静电吸引提升受体结合效率。

分子量约

2

72 Da。

分子式C110H172N24O30外观与溶解性白色粉末纯度≥98%水溶性良好弱酸性特征使其易溶于水、PBS 缓冲液pH

0-

7.

生理盐水溶解度可达 30 mg/mL 以上可溶于 50% 甲醇 / DMSO 混合溶剂微溶于纯乙醇不溶于氯仿、乙醚等非极性溶剂水溶液在生理 pH 下呈清澈透明状无聚集、无沉淀高浓度≥50 mg/mL仍保持稳定适用于体内外所有实验体系细胞实验建议浓度 10~1000 nmol/L。

稳定性-20℃干燥避光条件下可保存36 个月水溶液在 4℃下稳定 20 天37℃生理条件下半衰期约6 小时易被中性内肽酶、氨肽酶水解无氧化敏感位点无 Cys/Met肽链的线性柔性构象使其部分肽酶水解位点暴露抗酶解能力弱于天然三聚体 TNF-α但优于 TNF-α 其他短片段细胞实验中添加蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA可使半衰期延长至 12 小时以上短期储存可 4℃避光长期储存分装冻存即可避免反复冻融超 5 次活性无明显下降。

结构式

核心生物活性人源 TNF-α (46-

作为 TNFR1/TNFR2 的双靶点特异性配体核心生物活性均由 TNFR 介导的信号通路激活展开复刻了天然 TNF-α 的强效促炎、抗肿瘤、调控免疫细胞活化、促血管内皮细胞活化、轻度促凋亡等核心效应其生物活性具有TNFR 依赖性、浓度依赖性、细胞类型依赖性的特征低 - 中浓度下主要发挥免疫调控与促炎效应高浓度下可发挥抗肿瘤与促凋亡效应对正常细胞的毒性显著低于天然 TNF-α是研究 TNF-α 介导炎症与抗肿瘤免疫的理想工具肽核心生物活性如下

强效促炎症反应与免疫细胞活化这是该多肽最核心的生物活性通过激活免疫细胞与内皮细胞表面的 TNFR1/TNFR2启动并放大局部与全身炎症反应同时活化天然免疫与适应性免疫细胞激活巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞表面的 TNFR1促进其释放 ** 促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-

炎症介质前列腺素 E

一氧化氮** 与趋化因子CXCL

CCL2招募更多免疫细胞至炎症部位放大炎症反应激活 ** 树突状细胞DC** 表面的 TNFR1/TNFR2促进 DC 的成熟与抗原提呈能力增强其对 T 细胞的激活效率启动适应性免疫反应激活血管内皮细胞表面的 TNFR1促进黏附分子ICAM-

VCAM-

E - 选择素的表达使免疫细胞与内皮细胞黏附并渗出至炎症组织完成炎症细胞的浸润体外实验中100 nmol/L 的多肽即可使巨噬细胞的 TNF-α 释放量提升 80% 以上500 nmol/L 时促炎效应达峰值且炎症激活效应呈浓度依赖性。

特异性抑制肿瘤细胞增殖与诱导凋亡通过激活肿瘤细胞表面的 TNFR1触发胞内凋亡信号通路同时抑制肿瘤细胞增殖对多种肿瘤细胞肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤具有显著的抗肿瘤效应对正常细胞的促凋亡效应极弱与肿瘤细胞表面的 TNFR1 结合后激活死亡受体介导的外源性凋亡通路招募凋亡相关因子FADD、Caspase-8激活 Caspase 级联反应最终诱导肿瘤细胞凋亡同时抑制肿瘤细胞的细胞周期进展下调细胞周期正调控蛋白Cyclin D

CDK4/6的表达阻滞细胞周期于 G1/S 期抑制肿瘤细胞异常增殖体外肿瘤细胞实验中500 nmol/L 的多肽可使肝癌细胞的凋亡率提升 60% 以上增殖抑制率达 50%~70%且对正常肝细胞的凋亡率无显著影响选择性优于天然 TNF-α。

调控适应性免疫细胞的活化与功能通过激活 T 细胞、B 细胞表面的 TNFR2轻度调控适应性免疫细胞的活化、增殖与分化参与机体的免疫稳态调控激活CD4T 细胞、CD8T 细胞表面的 TNFR2促进 T 细胞的增殖与细胞因子IFN-γ、IL-2的分泌增强效应 T 细胞的抗肿瘤与抗病原体活性激活B 细胞表面的 TNFR2促进 B 细胞的增殖与抗体分泌增强体液免疫反应对调节性 T 细胞Treg具有轻度激活效应促进 Treg 的免疫抑制功能避免免疫反应过度活化维持免疫稳态该免疫调控效应为双向平衡低浓度下增强免疫应答高浓度下轻度抑制过度免疫无明显的免疫抑制或免疫亢进副作用。

促血管内皮细胞活化与血管生成调控通过激活血管内皮细胞表面的 TNFR1/TNFR2双向调控血管生成生理浓度下参与血管生理稳态病理浓度下参与炎症与肿瘤相关血管生成生理低浓度10~50 nmol/L激活 TNFR2促进血管内皮细胞的轻度增殖与迁移维持血管的生理更新与修复病理高浓度≥500 nmol/L激活 TNFR1促进血管内皮细胞分泌血管生成因子VEGF、bFGF诱导炎症部位与肿瘤组织的病理性血管新生为炎症细胞浸润与肿瘤生长提供通道同时可诱导血管内皮细胞的轻度凋亡参与炎症部位的血管重构

增强抗肿瘤免疫的协同效应作为免疫佐剂样分子可通过激活肿瘤微环境中的免疫细胞增强机体的抗肿瘤免疫效应与化疗、放疗、免疫治疗具有显著的协同作用激活肿瘤微环境中的巨噬细胞、树突状细胞增强其抗原提呈能力促进肿瘤相关抗原的交叉提呈激活肿瘤特异性 T 细胞促进CD8 细胞毒性 T 细胞的浸润与活化增强其对肿瘤细胞的杀伤效率抑制肿瘤微环境中的M2 型肿瘤相关巨噬细胞极化促进其向 M1 型促炎 / 抗肿瘤表型转换增强肿瘤微环境的抗肿瘤氛围体外实验中该多肽与顺铂联用可使肺癌细胞的杀伤效率提升 2~3 倍与 PD-1 抗体联用可显著增强肿瘤特异性 T 细胞的活化效率。

轻度诱导细胞凋亡与组织损伤高浓度高浓度下≥1 μmol/L可通过过度激活 TNFR1诱导正常细胞主要为上皮细胞、内皮细胞的轻度凋亡参与炎症介导的组织损伤这是 TNF-α 介导炎症性疾病如类风湿关节炎、炎症性肠病的核心机制之一过度激活的 TNFR1 可触发正常细胞的外源性凋亡通路同时促进活性氧ROS的生成导致细胞氧化损伤诱导炎症部位的组织细胞凋亡与坏死加重组织损伤形成 “炎症 - 组织损伤 - 更重炎症” 的恶性循环该效应为高浓度下的非特异性效应生理浓度下无明显组织损伤因此实验与应用中需严格控制剂量。

作用机理人源 TNF-α (46-

的所有生物活性均基于与 TNFR1/TNFR2 胞外域的特异性结合及下游信号通路的激活核心作用机理为多肽与 TNFR 结合→受体三聚化→激活胞内不同信号模块→介导促炎、抗肿瘤、免疫调控等效应该多肽虽为单体但可诱导 TNFR 发生三聚化触发下游信号其中与TNFR1 结合主要激活促炎 / 促凋亡信号通路与TNFR2 结合主要激活免疫调控 / 促增殖信号通路两条受体的信号通路相互独立又可交叉调控具体关键作用机制如下

受体结合与激活的分子机理该多肽与 TNFR1/TNFR2 的结合为诱导契合型多位点结合模式结合后触发受体三聚化是所有下游效应的分子基础多肽线性构象中的疏水核心基序LYLIYSQVLF与 TNFR1/TNFR2 胞外域的疏水口袋结合Leu/Val/Ile 的疏水侧链填充口袋Tyr¹¹/Tyr¹⁴的酚羟基与 TNFR 的 Ser/Asn 残基形成氢键Glu⁸的羧基、Lys²⁰的氨基与 TNFR 的碱性 / 酸性残基形成盐桥形成稳定的多肽 - TNFR 复合物单体多肽与 TNFR 结合后诱导 TNFR 发生同源三聚化TNFR1/TNFR1/TNFR1 或 TNFR2/TNFR2/TNFR2使受体胞内域的信号模块相互靠近三聚化后的 TNFR 根据亚型不同招募不同的胞内信号衔接蛋白启动下游特异性信号通路TNFR1 招募死亡域蛋白TRADD、FADDTNFR2 招募促增殖 / 调控蛋白TRAF

TRAF6。

促炎与抗肿瘤凋亡的分子机理TNFR1 介导TNFR1 介导的NF-κB 通路与外源性凋亡通路是该多肽促炎、抗肿瘤的核心通路二者可同时激活相互调控促炎通路NF-κBTNFR1 三聚化后招募 TRADD、TRAF

RIP1 等蛋白形成促炎信号复合物激活 IκB 激酶IKK使 IκB 磷酸化并降解释放 NF-κB p65/p50 二聚体入核启动促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、黏附分子、趋化因子的基因表达介导炎症反应促凋亡通路外源性凋亡当细胞内抗凋亡蛋白c-FLIP、Bcl-2表达较低时如肿瘤细胞TNFR1 三聚化后招募 FADD 与 Caspase-8形成死亡诱导信号复合物DISC激活 Caspase-8进而激活下游 Caspase-3/7启动细胞凋亡程序诱导肿瘤细胞凋亡两条通路的平衡由细胞内抗凋亡 / 促凋亡蛋白的表达水平决定这是该多肽对肿瘤细胞促凋亡、对正常细胞低毒性的核心原因。

免疫调控与促增殖的分子机理TNFR2 介导TNFR2 介导的NF-κB2 通路与PI3K/Akt 通路是该多肽免疫调控、促增殖的核心通路主要发挥免疫活化与细胞增殖调控效应NF-κB2 通路TNFR2 三聚化后招募 TRAF

TRAF6激活 NF-κB2 通路促进RelB/p52二聚体入核启动 ** 免疫细胞活化、增殖相关基因IL-

CD40L** 的表达促进 T 细胞、B 细胞的活化与增殖PI3K/Akt 通路TRAF2/6 激活后可进一步激活 PI3K/Akt 通路活化的 Akt 通过磷酸化抑制凋亡相关蛋白Bad、Caspase-9发挥抗凋亡、促增殖效应同时促进血管内皮细胞、免疫细胞的迁移两条通路协同介导免疫细胞的活化、增殖与功能调控维持机体的免疫稳态与细胞增殖平衡。

促炎与抗肿瘤协同的分子机理该多肽的促炎效应与抗肿瘤效应通过免疫细胞 - 肿瘤细胞的交叉调控实现协同核心为激活肿瘤微环境的抗肿瘤免疫多肽激活肿瘤微环境中的巨噬细胞、DC促进其分泌促炎细胞因子与趋化因子招募外周免疫细胞CD8T 细胞、中性粒细胞浸润至肿瘤组织激活的 DC 将肿瘤相关抗原提呈给 CD8T 细胞启动肿瘤特异性 T 细胞活化活化的 CD8T 细胞通过释放穿孔素、颗粒酶杀伤肿瘤细胞同时多肽直接结合肿瘤细胞表面的 TNFR1诱导肿瘤细胞凋亡释放损伤相关分子模式DAMP进一步激活免疫细胞形成 “免疫激活 - 肿瘤杀伤 - 更强化免疫” 的抗肿瘤循环。

核心应用领域与原理人源 TNF-α (46-

因具有TNFR1/TNFR2 双靶点结合活性、复刻天然 TNF-α 核心功能、低正常细胞毒性、易合成等特征是 TNF-α/TNFR 信号通路研究的经典工具肽其应用价值覆盖TNF-α/TNFR 信号通路分子机制研究、炎症调控机制研究、抗肿瘤免疫研究、抗炎 / 抗肿瘤靶向药物研发、免疫佐剂研发等领域核心应用领域与原理如下

TNF-α/TNFR 信号通路的解析研究以其TNFR1/TNFR2 双靶点结合、核心结合位点明确为特征作为金标准工具肽研究 TNF-α 与 TNFR 的结合机制、TNFR 下游信号通路的激活与交叉调控、受体脱敏 / 内化机制通过定点突变多肽的核心结合位点如 Tyr¹¹→Phe、Glu⁸→Ala研究关键氨基酸对 TNFR1/TNFR2 结合亲和力的影响解析 TNF-α 与 TNFR 的亚型选择性结合机制结合免疫印迹、荧光共聚焦、FRET 等技术研究 TNFR1/TNFR2 的三聚化过程、胞内信号复合物的形成及下游 NF-κB / 凋亡通路的激活动力学用于研究 TNFR 的信号脱敏机制如受体内吞、泛素化降解解析机体对 TNF-α 的炎症耐受机制为炎症性疾病的治疗提供依据。

炎症性疾病的病理机制研究以其强效促炎活性、双靶点结合特征为特征作为工具分子研究类风湿关节炎、炎症性肠病、脓毒症等 TNF-α 介导炎症性疾病的发病机制在体外巨噬细胞 / 内皮细胞炎症模型、体内小鼠胶原诱导关节炎CIA/ 葡聚糖硫酸钠DSS肠炎模型中通过外源性添加该多肽模拟 TNF-α 介导的炎症反应研究炎症信号通路的激活与组织损伤机制研究 TNFR1/TNFR2 在炎症性疾病中的功能差异明确 TNFR1 为促炎主要受体、TNFR2 为炎症调控受体的作用模式为炎症性疾病的亚型特异性靶向治疗提供实验依据用于研究炎症性疾病中的免疫紊乱机制解析 TNF-α 过度激活对免疫细胞功能的影响。

抗肿瘤免疫的机制研究与应用以其抗肿瘤与免疫激活双重活性为特征作为工具分子研究 TNF-α 介导的抗肿瘤免疫机制、肿瘤微环境的免疫调控机制在体外肿瘤细胞 - 免疫细胞共培养模型、体内裸鼠移植瘤模型中通过该多肽激活抗肿瘤免疫研究 CD8T 细胞、巨噬细胞在 TNF-α 介导抗肿瘤免疫中的核心作用研究肿瘤微环境中TNFR1/TNFR2 的表达差异对肿瘤免疫的影响解析肿瘤细胞通过下调 TNFR1 表达逃避免疫杀伤的机制用于研究 TNF-α 与其他免疫检查点如 PD-

CTLA-4的协同调控机制为肿瘤免疫联合治疗提供实验依据。

抗炎 / 抗肿瘤靶向药物的研发与筛选以其TNF-α 核心结合域特征为基础作为筛选模板与阳性对照构建 TNF-α/TNFR 靶向药物的高通量筛选模型研发新型抗炎 / 抗肿瘤药物以该多肽与 TNFR1 的结合为模型构建分子水平的竞争性结合筛选模型筛选TNFR1 特异性拮抗剂如肽类、小分子抑制剂、抗体用于类风湿关节炎、脓毒症等炎症性疾病的治疗以该多肽与 TNFR2 的结合为模型筛选TNFR2 特异性激动剂用于增强抗肿瘤免疫、提升免疫治疗效果以该多肽为天然模板通过环肽化改造、定点突变研发TNFR 亚型选择性配体实现抗炎 / 抗肿瘤的精准靶向治疗避免天然 TNF-α 的全身副作用。

免疫佐剂与肿瘤疫苗的研发以其免疫激活活性、无明显毒性为特征作为天然免疫佐剂模板研发新型肿瘤疫苗 / 疫苗佐剂提升疫苗的免疫原性将该多肽与肿瘤相关抗原TAAs/ 疫苗抗原偶联构建多肽 - 抗原融合疫苗利用其免疫激活活性增强 DC 的抗原提呈能力提升疫苗诱导的特异性 T 细胞免疫应答将该多肽作为佐剂添加至肿瘤疫苗 / 传统疫苗中替代铝佐剂等传统佐剂提升疫苗的免疫效果同时诱导长效的记忆性免疫应答其免疫激活活性为天然非毒性无传统佐剂的局部炎症 / 全身发热副作用是新型佐剂的理想研发模板。

化疗 / 免疫治疗的增敏剂研发以其增强抗肿瘤免疫、逆转肿瘤耐药为特征作为增敏剂模板研发化疗 / 免疫治疗的新型增敏剂提升肿瘤治疗效果以该多肽为基础研发肿瘤微环境靶向的修饰体如与肿瘤靶向肽偶联实现多肽在肿瘤微环境的局部富集激活肿瘤微环境的抗肿瘤免疫增强化疗 / 放疗对肿瘤细胞的杀伤效率研发该多肽的长效化修饰体如 PEG 化、棕榈酰化提升其体内半衰期与 PD-1/PD-L1 抗体联用增强免疫治疗的效果逆转肿瘤细胞的免疫逃逸。

研究进展与应用前景目前针对人源 TNF-α (46-

的研究已从基础的理化性质、生物活性解析逐步深入至TNFR 结合机制、亚型特异性修饰、抗炎 / 抗肿瘤药物研发、免疫佐剂研发等阶段作为 TNF-α 的核心功能片段其基础研究与应用研究均取得了一系列关键进展同时在抗炎 / 抗肿瘤靶向药物研发、免疫佐剂研发、肿瘤联合治疗等领域具有广阔的临床转化前景核心研究进展与前景如下

核心研究进展解析了该多肽与人源 TNFR1 胞外域的复合物晶体结构分辨率

2 Å从原子层面明确了 Tyr¹¹、Glu⁸、Leu⁹等关键氨基酸与 TNFR1 的结合位点证实疏水相互作用与氢键是结合的核心为 TNFR1 特异性拮抗剂的精准设计提供了结构基础实现了该多肽的TNFR 亚型选择性改造通过定点突变Lys²⁰→ArgVal³→Ala获得TNFR2 高选择性激动剂对 TNFR2 的结合选择性提升至 50 倍以上无 TNFR1 结合活性在小鼠移植瘤模型中该修饰体可显著增强抗肿瘤免疫无促炎副作用研发了该多肽的长效化与肿瘤靶向修饰体P

化 RGD 肽偶联修饰后体内半衰期从 6 小时延长至36 小时并可靶向肿瘤血管内皮细胞在裸鼠移植瘤模型中该修饰体的抗肿瘤效果提升至原肽的 3 倍且无全身促炎副作用证实了该多肽作为肿瘤疫苗佐剂的有效性将其与 OVA 肿瘤抗原偶联后在小鼠黑色素瘤模型中疫苗诱导的肿瘤特异性 CD8T 细胞应答提升 4 倍以上肿瘤抑制率达 80%发现了该多肽对脓毒症的免疫调控潜力在小鼠脓毒症模型中低剂量给药可通过激活 TNFR2 调控免疫细胞功能降低脓毒症的死亡率且无加重炎症的副作用。

应用前景TNFR 亚型特异性药物临床转化基于该多肽改造的TNFR1 拮抗剂与TNFR2 激动剂将进入临床前研究分别用于炎症性疾病类风湿关节炎、脓毒症与抗肿瘤免疫治疗实现 TNF-α 靶向治疗的精准化避免天然 TNF-α 抑制剂的免疫抑制副作用新型免疫佐剂研发将该多肽开发为商品化的疫苗佐剂用于肿瘤疫苗、新型传染病疫苗的研发提升疫苗的免疫原性与保护效率肿瘤联合治疗方案开发探索该多肽的肿瘤靶向修饰体与 PD-1/PD-L1 抗体、化疗药物、溶瘤病毒的协同效应开发肿瘤的免疫激活 靶向杀伤联合治疗方案提升肿瘤治疗的整体效果TNF-α 研究工具商品化将该多肽开发为商品化的 TNF-α/TNFR 信号通路工具肽用于炎症、肿瘤、免疫相关的基础研究成为生命科学研究的标准化工具炎症性疾病的精准治疗基于 TNFR1/TNFR2 的功能差异开发TNFR1 拮抗剂 TNFR2 激动剂的联合治疗方案用于类风湿关节炎、炎症性肠病等难治性炎症性疾病的治疗实现抗炎与免疫调控的双重效果。

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